Na czym polega badanie DNA metodą PCR?- jak pracuje laboratorium molekularne

Na czym polega technika PCR?

PCR to badanie wykorzystywane w diagnostyce molekularnej wielu chorób. Metoda PCR pozwala na wykazanie bezpośredniej obecności patogenu w badanym materiale, a konkretnie jego materiału genetycznego (DNA lub RNA).

W ostatnich latach metody diagnostyki molekularnej bardzo się rozwinęły zajmując stałe miejsce w diagnostyce wszelkiego typu wirusów, bakterii, grzybów, pasożytów oraz predyspozycji genetycznych do wielu chorób, w tym nowotworów.

PCR (ang. polymerase chain reaction), czyli reakcja łańcuchowa polimerazy, jest podstawową metodą stosowaną w laboratoriach genetycznych i molekularnych. Została opracowana w ubiegłym wieku przez Kary’ego Mullis’a, który otrzymał za to w roku 1993 Nagrodę Nobla.

Na czym polega technika PCR?

Badanie PCR polega na wielokrotnym powieleniu (zwykle w 30-40 cyklach) specyficznego fragmentu DNA, np. genów kodujących białka krętka Borreli, za pomocą enzymu polimerazy.

Następnie w celu uwidocznienia namnożonego fragmentu DNA stosuje się specjalne barwniki molekularne, których sygnał odczytywany jest na żelu agarozowym (zwykły PCR) lub specjalistycznym aparacie (Real-Time PCR).

PCR, dzięki powielaniu określonych fragmentów DNA, jest metodą ultraczułą.

W metodzie PCR za pomocą specyficznych par starterów dla danego regionu DNA bakterii namnaża się fragmenty DNA. Startery są tak dobrane, by łączyły się z DNA jedynie ściśle określonego gatunku, zapewniając 100% specyficzność badania. Tzn. pewność, że wykryty patogen, jest dokładnie tym, którego poszukiwaliśmy.

Jaki materiał można poddać badaniu PCR?

Materiał biologiczny, z jakiego można wykonywać badanie metodą PCR, to:

  • krew
  • wymaz (np. z jamy ustnej, wymaz uro-genitalny, wymaz ze spojówki itp.)
  • cytologia cienkowarstwowa w podłożu płynnym
  • fragment tkanki (np. wycinek dziąsła do badania w kierunku wirusa HPV)
  • mocz (z osadem)
  • kał (badanie w kierunku pasożytów)
  • nasienie (badanie w kierunku infekcji, będących przyczyną stanów zapalnych jąder czy prostaty, oraz w diagnostyce niepłodności)
  • kleszcz (analiza pod kątem obecności krętków Borreli i koinfekcji)
  • inne (np. zeskrobiny płytki paznokcia, mleko kobiece, płyny wysiękowe)

Zastosowanie metody PCR

  • diagnostyka i monitorowanie zakażeń wirusowych: HPV (brodawczak powodujący m.in. raka szyjki macicy), herpeswirusami (wirus opryszczki, półpaśca, Epstein-Barr, cytomegalii), HIV, wirusami zapalenia wątroby (HBV i HCV), rozróżnianie poszczególnych typów wirusa grypy (A, B, C)
  • diagnostyka i monitorowanie zakażeń bakteryjnych, szczególnie tych bakterii, których nie udaje się zidentyfikować poprzez hodowle np. gruźlica, kiła
  • diagnostyka parazytologiczna, gdzie materiałem jest kał, mocz lub wymaz
  • diagnostyka i monitorowanie chorób nowotworowych, m.in.: białaczek, raka piersi, raka jelita grubego, raka płuc
  • diagnostyka predyspozycji do nowotworów np.raka piersi i jajnika (geny BRCA1 i BRCA2)
  • diagnostyce chorób o podłożu genetycznym: hemochromatozy (gen HFE), talasemii (geny HBA1 i HBA2), celiakii (geny HLA) , zakrzepicy (gen MTHFR, F5, F2, PAI)
  • diagnostyka niepłodności: (AZF, MTHFR, PAI)
  • testach na ojcostwo, w których wykrywa się zgodność DNA dziecka i ojca

Obecnie istnieje wiele modyfikacji metody PCR. Na przykład, w diagnostyce boreliozy z Lyme stosowane są głównie metoda gniazdowego PCR (ang. nested PCR) oraz PCR w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR). Ta ostatnia jest metodą ilościową i pozwala na określenie dokładnej liczby kopii DNA krętka Borrelia w badanym materiale biologicznym.

 

Przewaga badania PCR nad tradycyjnymi metodami diagnostycznymi:

vs

                           

Diagnostyka metodą PCR umożliwia szybkie i precyzyjne wykrycie patogenów, w tym trudnych do hodowli tradycyjnymi metodami mikrobiologii. Umożliwia zatem wykrycie patogenów, których nie udało się wychodować na pożywkach mikrobiologicznych czy zaobserwować pod mikroskopem w preparacie bezpośrednim.

Umożliwia wykrycie patogenów w tzw. okienku serologicznym, tzn. czasie, w którym nie doszło jeszcze do wykształcenia odpowiedzi immunologicznej organizmu na obecność patogenu.

 

Wynik testu PCR daje odpowiedź na pytanie: czy w danej chwili w badanym materiale występują określone drobnoustroje lub pasożyty (szukamy ich „fizycznej obecności” w postaci śladu DNA/RNA).

 

Natomiast wyniki testów serologicznych (np. IgM, IgG) oparte są na obecności przeciwciał, tzn. odpowiedzi organizmu na styczność z patogenem. Ta styczność mogła mieć miejsce rok, miesiąc, tydzień wcześniej i wcale nie znaczy o tym, że patogen nadal jest obecny w naszym organizmie. Styczność z patogenem nie musi zawsze skutkować zachorowaniem. Uzależnione jest to od wielu czynników, m.in. od poziomu odporności człowieka.

 

PCR – wyniki. Czy mogą być fałszywie dodatnie?

PCR jest metodą ultraczułą i jednocześnie bardzo wrażliwą na zanieczyszczenia. Dlatego bardzo istotne w testach opartych o PCR jest dobranie odpowiedniej kontroli wewnętrznej w celu wykluczenia wyników fałszywie dodatnich.

Kluczowe również jest prawidłowe pobieranie materiału do badań oraz doświadczenie i rzetelność pracy diagnosty wykonującego badanie.

 

PCR – wyniki. Czy mogą być fałszywie ujemnie?

Jak w każdym badaniu laboratoryjnym również w metodzie PCR mogą pojawić się wyniki fałszywie ujemne. Najczęstszą przyczyną wyników fałszywie ujemnych jest błąd przedlaboratoryjny, np. niewłaściwe pobranie materiału, niewłaściwy materiał do badania, nieprawidłowe warunki przechowywania materiału.

Kluczowe jest pobranie materiału, np. krwi na odpowiedni antykoagulant, ponieważ niektóre z nich jak heparyna mogą zahamować reakcję PCR.

Również pobranie materiału po rozpoczęciu antybiotykoterapii może powodować spadek wydajności reakcji PCR oraz większe prawdopodobieństwo pojawienia się wyników fałszywie ujemnych. O takich sytuacjach należy powiadomić laboratorium przed pobraniem materiału i upewnić się czy w danych przypadku materiał będzie nadawał się do analizy.

Etapy diagnostyki metodą PCR

1. przyjęcie materiału do laboratorium (wstępna analiza przydatności materiału do badań) i rejestracja zlecenia

2. izolacja DNA/RNA

3. właściwa reakcja PCR

4. analiza wyników reakcji PCR

5. wydanie wyniku

6. konsultacja lekarza specjalisty